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糖化血红蛋白定量分析

  2011年世界卫生组织推荐:在有条件的地区采用糖化血红蛋白(HbA1c)诊断糖尿病。HbA1c达标是糖尿病血糖控制目标以及评价糖尿病治疗方案有效性的标准,是20世纪90年代中期开始在国际上逐步推广应用的一个指标。目前,在相当一部分国家和地区HbA1c是糖尿病首选诊断指标,我国新版2型糖尿病防治指南(2013年版)建议:“暂不推荐在我国将HbA1c作为糖尿病诊断切点,但对于采用标准化检测方法,并有严格质量控制,正常参考值在4.0%~6.0%的医院,HbA1c≥6.5%可作为诊断糖尿病的参考。”因此,保证HbA1c测定质量十分重要。

  一、糖尿病首选的诊断指标

  糖尿病首选的诊断指标为什么是HbA1c而不是我们耳熟能详的血浆(清)葡萄糖?这主要源于糖尿病诊疗理念的变迁。以往糖尿病主要是依靠临床症状和体征而被定义、识别和诊断的,血糖水平仅作为确定诊断和鉴别诊断的辅助指标,随着医学的发展、进步,糖尿病已经从与机体不适和病痛相关的“临床疾病”演变为依据与亚临床性糖尿病微血管损害相关的血糖水平而诊断的“数字病”,在这种情形下,血糖水平的检测从辅助诊断的位置上升到诊断糖尿病的主要地位。因此,血糖检测的准确性、多次检测的可重复性以及基于血糖的诊断方法的可操作性就成为人们越来越关注的问题,而采用简单、易行且重复性好的糖尿病诊断工具也是现实糖尿病防治工作中提出的重要需求。

  传统的血浆(清)葡萄糖测定存在一些无法解决的问题:首先是生物学变异大,同一个体内差异达到5.3%~8.3%,不同个体间则可以达到12.5%;其次是需要特定时间采血,空腹血糖需要空腹8h以上,口服葡萄糖耐量试验更是耗时;还易受短期生活方式改变的影响;最棘手的问题是体外糖酵解,采血后离体血糖随着时间的推移葡萄糖浓度会下降,即使采用氟化钠作为糖酵解抑制剂,由于其作用机制是通过抑制参与糖酵解的酶的活性而达到抑制糖酵解的目的,所以其起效也要在4h以上;因此,无法达到检测的准确性和多次检测的可重复性的要求。而HbA1c由于是葡萄糖与血红蛋白结合的稳定产物,所以其具有:离体样本稳定,常温可稳定24h;生物学变异小,在2.0%以内;且无需空腹,可任意时间采血;相对来讲不受短期生活方式改变的影响等特点;更为重要的是,HbA1c测定有国际公认的参考体系,可以监测其结果的准确性;HbA1c还有一个非常突出的特点,那就是:与糖尿病血管并发症的相关性好于血浆(清)葡萄糖。所以,HbA1c的测定能满足糖尿病防治工作的需求。

  为适应HbA1c临床应用发展的需要,提高HbA1c的测定质量,卫生部临床检验中心等多家机构和医院的检验学与临床专家根据我国HbA1c检测现状、结合国内外相关理念共识和研究进展、经广泛征求意见制定了《糖化血红蛋白测定专家共识》(以下简称“共识”)。笔者从以下几个方面进行评析、解读,供相关同仁参考。

  二、知晓干扰因素、重视结果报告与临床的结合

  随着检验医学的迅猛发展,现代检验医学的理念已经发生了根本性的变革。临床实验室由以往的“以样本为中心,以数据为目的、只见数据不顾人”,发展到现在以“患者为中心,为临床诊疗提供可靠依据为目的”,不仅重视可能影响测定结果质量的各个环节,且综合分析、全面评判可对检测结果产生影响的多种因素。

  1.关于HbA1c的报告应提供“检测方法学名称”:

  人体是一个复杂的生物工厂,使得检验指标存在一些干扰因素,HbA1c也不例外。由于HbA1c是红细胞中血红蛋白与葡萄糖的结合产物,因此,任何引起血红蛋白数量与质量变化的因素都可干扰HbA1c测定,对检测结果产生影响。HbA1c测定的干扰因素包括:血红蛋白病、红细胞寿命的缩短或增加、药物、严重黄疸、高脂血症、族群、年龄及妊娠等。有些HbA1c测定方法可避免或在一定程度上减少一些因素的干扰。也就是说,有些人群(如某些血红蛋白病患者)可以选择不受自身疾病干扰的方法检测HbA1c,这就是所谓的“方法学特异”。而“非方法学特异”是指无论采用何种方法都无法克服,如尿毒症患者等人群不宜采用HbA1c来反映体内平均血糖水平。

  由于上述原因,使得HbA1c测定结果与临床诊疗及表现不一致的情况时有出现,此时实验室报告如能提供“方法学名称”,可便于临床医师分析、判断本医疗机构实验室所采用的方法除了满足大多数患者的需求外,是否还能满足一些少数特殊患者的需求。因此,共识中建议:实验室签发的报告应提供“方法学名称”。

  令人欣慰的是,随着检测技术的改进,常见的血红蛋白病对一些检测方法的干扰在逐渐降低,如血红蛋白S和血红蛋白C会干扰一些免疫法和个别离子交换HPLC法,血红蛋白E和血红蛋白D对一些离子交换HPLC法有干扰,但对免疫法基本没有干扰。需要注意的是,某些离子交换HPLC法在参考范围内不受血红蛋白S、C、E和D的干扰,但随着HbA1c浓度的增高,干扰也会增加;当血红蛋白F浓度<10%时,基本不影响HbA1c测定结果,一旦浓度>10%,对目前国际上通用的方法几乎都有干扰,干扰随着浓度的升高而增加,这一点需注意。

  2.关于提供“参考范围”:

  实验室必须为检测指标提供可靠的参考区间,才能使临床医师根据测定结果判断健康者、了解患者病情,以发挥结果报告的作用。HbA1c作为有溯源性的诊断指标,其测定结果应该具有跨时空、跨检测系统的一致性和可比性,也就是说,同一份样本在不同时间、不同地点、采用不同品牌仪器进行检测,其结果相差应该在一定的允许范围内,这就是具有可比性。但事实上,由于各种各样的原因,使得某些实验室的HbA1c测定结果难以做到可比,导致参考范围差别很大。据“中国糖化血红蛋白教育计划”对全国部分省、市的调查结果显示:HbA1c的测定在许多不同级别的医疗单位都有开展;581家医学中心的HbA1c报告参考范围多数为可接受的4%HbA1c~6%HbA1c左右,但有一部分却相差很大,低限为3%HbA1c~10%HbA1c,高限则可达到20%HbA1c。如实验室报告能提供“参考范围”,可便于临床医师了解、判断检测结果的可靠性,因此,共识中还建议:实验室签发的报告应提供“参考范围”。

  临床实验室应避免频繁变更检测方法,如需更改,应提前与临床医师沟通,除告知影响方法测定结果的干扰因素外,还要尽可能提供相关的信息,以便于临床医师分析、判断报告的可靠性,更合理地应用HbA1c结果。

  三、HbA1c检测方法评价和选择的重要性

  方法性能评价的重要性正被越来越多的医学界同行所关注,从保证检测质量的角度出发,临床实验室在使用新的方法对患者样本进行检测前,必须结合本单位的具体条件,用试验结果去评价方法的基本性能,只有确认方法的分析性能符合临床使用要求时,才可以将其用于实验室常规工作。对方法性能的评价应做到2个方面:首先,按照正确的方法进行检测;其次,按照正确的标准评估检测结果。需要说明的是,方法不仅仅是仪器,还要包括试剂、校准物等,即所谓的“分析系统”,分析系统性能涉及仪器、试剂、校准物和质控物的批号、有效期、保存和使用条件、相关操作人员的能力、操作规程的合理性以及环境等因素。其中任何因素的改变,都会对检测结果的准确性产生影响。如:不同批号的试剂是否有差异,不同操作人员的能力是否都符合要求,操作人员的生物安全是否有保障等。

  HbA1c测定方法有多种,不同方法所应用的原理不同,测定组分各异。20世纪90年代中期,美国国家糖化血红蛋白标准化计划(National Glycohemoglobin Standardization Program,NGSP)及国际临床化学与医学实验室联盟(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)对HbA1c的测定进行标准化工作,明确了HbA1c分子结构,建立了国际公认的参考体系,因此,HbA1c测定是可溯源的,其结果的准确性可被国际参考体系评估。临床实验室所选择的测定方法,应既能满足简便快速、可批量测定、及时发出报告的要求,也必须保证测定结果质量。采用可靠的方法进行检测是保证结果质量的基本前提。对于HbA1c测定,目前的共识是:所用方法应该可溯源至IFCC参考方法,厂商应提供可溯源至IFCC参考方法的相关证明。可溯源的方法即标准化方法,具体体现就是经过有资质的、相关专业机构的认证,在此方面做了大量工作的是美国的NGSP。其通过对厂家方法的认证,从源头对HbA1c检测进行标准化;通过不断提高认证标准,达到不断提高出厂方法质量的目的,这也是NGSP对HbA1c测定实现标准化的重要贡献。

  需要指出的是,得到NGSP认证的方法质量也是不同的,有些方法在使用一段时间后,尤其是在更换不同批号的试剂后,难以保证测定结果的可比性,因此,对分析系统性能的评价工作不仅仅是在分析系统使用前需要进行。对于没有经过有资质的、相关专业机构认证的HbA1c检测方法,不仅需对其精密度和准确度进行实验,初步判定分析系统性能的可接受性,还需对其他结果的可接受性进行评判,如:干扰因素、可报告范围等,从而对分析系统性能结果进行综合评估,进而判断整个分析系统的可接受性。

  1.HbA1c测定方法的精密度与准确度:

  精密度由不精密度体现,常用变异系数表达。对检测方法而言,精密度通常是首先考虑的性能指标,因准确性建立在精密度基础上,没有好的精密度,其他指标都失去意义。目前国际上对HbA1c测定准确度的要求是:实测值与可接受参考值(真值)的差值在±0.5%HbA1c范围内,如达到此测定质量目标,则应满足室内变异<2.0%,只有控制此标准,才可控制室间变异<3.5%,从而达到±0.5%HbA1c测定质量目标。目前,一些在国际上普遍采用、质量比较可靠的方法均能达到此标准,但并不是所有,包括一部分得到NGSP认证的方法。对于HbA1c检测来说,0.5%HbA1c是一个怎样的概念呢?2009年,美国国家卫生统计中心对全国>25岁,且无糖尿病史的成年人调查结果显示:以6.5%HbA1c为例,对应的人口数量是240万;而减少0.5%HbA1c,也就是6.0%HbA1c的人数达到710万;如果增加0.5%HbA1c,7.0%HbA1c的人口则锐减为150万。真可谓“差之毫厘、谬以千里”。鉴于我国目前HbA1c检测的具体情况,共识中建议:临床实验室应控制HbA1c测定的室内变异<3.0%,以达到室间变异<5.0%的要求,此HbA1c检测质量可满足HbA1c作为糖尿病血糖控制指标的需求,如能控制室内变异<2.0%,则检测质量更有保障。精密度直接影响测定结果的准确性,因此,改善分析系统的精密度,是提高测定质量的重要措施。

  2.关于即时检测(point-of-care testing,POCT)的HbA1c结果:

  快速、简便、易于操作是POCT的特点,但同时也带来了质量控制的难题。传统检验一批试剂可测成百上千个样本,质量是一致的,而POCT的每一个测试都是独立的,如何保证每个测试的质量都一致,则是目前面临的最大难题。近几年,业界权威杂志连续发表专家述评、方法学评价报道:大多数通过NGSP标准化认证的POCT方法检测HbA1c结果的精密性、准确性无法满足临床需求。曾有权威实验室对市场上常见的8款HbA1c的POCT产品性能进行全面质量评价,结果显示:6款产品质量无法达到要求,其中,不同批号试剂对测定结果的影响尤为突出。一些糖尿病组织明确规定,POCT测定结果不能用于糖尿病诊断。美国糖尿病学会在2014年初更新的《糖尿病诊疗规程》中则建议,HbA1c的POCT结果可用于糖尿病监测。

  以上问题提示,对检测方法正确的评价和选择是保证HbA1c测定质量的基本前提。

  四、应加强规范化操作的理念

  规范化操作在检测过程中起着举足轻重的作用,检测不仅需要可靠的方法,还必须有合理、规范的操作过程,才能得到准确的结果。以2012年临床检验中心室间质量评价调查为例:此次活动共发放5个浓度水平的新鲜冰冻全血样本,按照方法分组,为:有一点需要“可通过标准”靶值±12%×靶值,说明的是,我们的“可通过标准”相比同期国际标准要宽松。结果显示,5个水平中没有一个方法组的通过率为100%,包括目前国际上普遍采用的、质量比较可靠的方法组,也就是说,有的实验室虽然使用了比较可靠的方法,但测定结果质量却不高,没有达到预期效果。这说明操作可能并没有达到规范化,所以,在此强调:应注重操作人员综合能力的培养,因为再先进的仪器都有其局限性或不足,需要操作者不仅按照标准操作程序完成操作过程,还应对可疑结果作出合理、正确的研读和判定,杜绝错误报告的发出。

  五、质量控制在HbA1c测定全程质量保证工作中的作用

  质量保证是临床最为关注的问题,直接关系到医疗水平及医师、患者切身利益,唯有把握好质量控制工作,才能保证测定结果质量。结果质量监测主要由2部分组成:内部质量控制和外部质量评价。内部质量控制的主要目的是监测分析系统稳定性,即进行室内质控物的测定,通过对质控物的测定,评估系统的精密度,以达到了解、控制系统稳定性的目的。实验室分析系统精密度的合理估计应包括批内和批间两部分,因此,应收集不同批次的重复测定结果以估计总变异,并作为常规分析数据质量控制的依据,其结果的有效性、可靠性随时间的延长而增加。

  选择HbA1c室内质控物时应特别注意质控物在使用过程中存在的“互换性”问题,由于冻干粉质控物与患者新鲜血之间存在差异,在更换试剂批号或仪器的关键配件(如色谱柱)时冻干粉质控物可能表现出不同的基质效应,因此会对测定结果有一定的影响。

  外部质量评价的目的是监测测定结果准确性,主要体现方式为室间质量评价(external quality assessment,EQA)或能力验证(proficiency testing,PT),室间质量评价是目前国际通用的评价实验室质量也会不断提高。测定结果可靠性从而改进测定质量的有效手段,通过室间质量评价活动可获知同一方法在不同实验室间的不精密度,可以提示室内质控难以发现的偏差和系统误差,识别问题并制定相应的改进措施。对HbA1c测定而言,目前的要求是,不同测定方法的结果应具可比性,不同方法组应采用同一靶值进行评价,这就对方法精密度提出了更严格的要求。由于不同基质效应的问题,HbA1c室间质量评价所用样品应尽量采用新鲜患者样本,样本浓度也应当接近医学决定水平,这对于HbA1c用于无症状人群的筛查、血糖管理治疗方案的制定及判断疗效非常重要。

  HbA1c的临床实验室常规测定方法自20世纪70年代末问世以来,几经变革及改进,我国目前不同实验室使用方法种类繁多、品牌各异,有些实验室的检测质量与国际水平有一定差距。虽然这种现状在短时间之内难以改变,但我们可以把握一个原则,那就是:使用质量有保证的实验室的检测结果。实验室如能做到根据患者临床诊疗的实际需求,选择恰当的方法、准确地进行检测、全程监测结果质量并能合理地解释、分析及判断测定结果,相信我国HbA1c测定结果的可比性会不断改善,测定质量也会不断提高。